Innhold
Lise er et gresk ord og betyr ganske enkelt "å dele" eller "å spalte". Det er en god beskrivelse av reaksjonen som skjer med celler i en lysepuffer, en løsning som bryter dem ned for å trekke ut innholdet. Forskere bruker disse løsningene for å ekstrahere DNA eller proteiner i celleanalyse, spesielt når det gjelder bakterier. Typen av cellelysebuffer varierer avhengig av type eksperiment, men vi vil nevne noen vanlige valg.
Buffer og salt
Bufferløsningene stabiliserer pH, mens cellene gjennomgår lyseprosessen. Tris-HCL-løsningen er den vanligste bufferen for buffring ved pH 8, hvis pH er ønsket. HEPES er en annen vanlig bufferløsning i disse eksperimentene. Natriumklorid kan også tilsettes for å øke ionestyrken, den totale konsentrasjonen av oppløste stoffer utenfor cellene. Sistnevnte er viktig siden vann kan spre seg til alle cellemembraner, fra regioner med lav oppløst konsentrasjon til de med høy konsentrasjon.
Vaskemiddel
Vaskemiddel er hovedingrediensen som løser opp cellemembranen slik at innholdet kan rømme. Vaskemidler er amfipatiske molekyler, det vil si med den ene enden som enkelt interagerer med vannmolekyler mens den andre hydrofobe enden, eller "som er redd for vann", ikke gjør det interaksjonen. De kan oppløse fett ved å danne miceller, små grupper, der de hydrofobe halene i vaskemiddelmolekylene peker innover mot fettmolekylene. Vanlige vaskemidler er natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 og tritonX.
Chelaterende midler og hemmere
Lysebuffere inneholder vanligvis også chelateringsmidler som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller retylenglykoltetraeddiksyre (EGTA). Disse kjemikaliene binder seg til metallioner med en +2 ladning (for eksempel magnesium og kalsium), noe som gjør dem utilgjengelige for andre reaksjoner. Mange DNAser (proteiner som tygger DNA) og proteaser (proteiner som kutter andre proteiner) trenger magnesiumioner for å fungere, så ved å frata dem denne hovedingrediensen, EDTA og EGTA, hjelper de med å redusere nivået av protease eller av DNAse-aktivitet. Imidlertid utelukker de dem ikke helt, og noen proteaser er ikke avhengige av magnesiumkofaktorer, så lysebuffere inneholder noen ganger også stoffer som kalles proteasehemmere, som binder seg til den og forhindrer at den fungerer som den skal.
Alkalisk lysis
Alkalisk lysis er en veldig vanlig teknikk for å rense plasmider fra bakterier. Denne metoden innebærer bruk av tre løsninger. Den første inneholder glukose, tris-HCL-buffer, EDTA og RNAses. Glukose skaper en høy konsentrasjon av oppløste bakterier utenfor, slik at de blir litt slappe, noe som letter lyseprosessen. EDTA og tris-HCL fungerer som tidligere beskrevet, mens RNAse vil tygge noe RNA inne i cellen for å få det ut av veien. Den andre løsningen gjør cellelyse effektivt. Den inneholder vaskemiddelet SDS og NaOH, som øker pH til 12 eller høyere, denaturerer proteinene inne i cellen og får DNA til å skilles i enkle filamenter. Den tredje løsningen inneholder kaliumacetat for å gjenopprette pH til et mer nøytralt nivå, slik at plasmid-DNA-strengene kan komme sammen. I mellomtiden kommer de denaturerte proteinene sammen og utfelles, mens dodecylsulfationene sammenføyes med kaliumionene for å danne en uoppløselig forbindelse, som også kan utfelle ut av løsningen.