Innhold
Agarosegelelektroforese er en vitenskapelig prosedyre som brukes i forskning og diagnostiske prosjekter som involverer studiet av nukleinsyrer. Det tillater forskeren eller tekniker å separere de ladede nukleinsyremolekylene, slik som DNA, i henhold til deres størrelse, og brukes til å analysere produktene som genereres av forsøket, slik som polymerasekjedereaksjonen. Det brukes rutinemessig fordi det er billig å løpe, rask prosess og tillater gjenoppretting av nukleinsyren som analyseres.
Gjør gelen
Samle alle nødvendige gjenstander og rengjør dem med 70% etanol. Elementer inkluderer gelstøpt brett, lim, agarose i laboratoriekvalitet, kolber eller sylindre, 10x konsentrasjon (Tris-Borate-EDTA, TBE) -rørbuffer, etidiumbromid, fargestoff og prøven som skal analyseres. Sørg også for at du har et gelelektroforese reservoar og strømkilde. Agarose fremstilles ved å veie den passende mengde DNA-tape som skal analyseres, blande det med TBE-bufferen og smelte i mikrobølgeovnen. Generelt er en 1% til 2% løsning tilstrekkelig til å dekke mange DNA-strengene som studeres i den daglige molekylærbiologi. Små DNA krever mer konsentrerte geler, mens større krever mer fortynnede geler. Agaroseoppløsningen blandes med etidiumbromid, som vil binde til nukleinsyren under elektroforeseprosedyren. Denne løsningen helles i smeltebrettet av gelen, akkurat som en støpingskam settes inn, og blandingen blir igjen for å størkne.
Sett inn og aktiver gelen
Gelen fjernes fra brettet og nedsenkes i et gelelektroforese reservoar inneholdende løpebuffer. Prøvene som skal analyseres blandes med fargestoffer og plasseres i brønner i gelen skapt av kammen. En markør eller skala er også inkludert for å tillate etterforskeren å se fremdriften av elektroforeseen og bestemme størrelsen på fragmentene som genereres. En elektrisk strøm blir deretter påført gelen, noe som tvinger prøven til å migrere fra den ene enden av gelen til den andre. Under denne prosessen separeres nukleinsyrene i prøven i fragmenter av forskjellige størrelser, med større molekyler nærmer seg brønnen, og mindre molekyler beveger seg til den andre enden av gelen.
Analyser gelen
Etter avslutning av elektroforeseprosedyren fjernes gelen fra reservoaret og plasseres i en UV-transilluminator, som belyser nukleinsyrefragmentene som binder til fluorescerende etidiumbromid. Et fotografi av dette er gjort, og båndene til nukleinsyrene kan måles i henhold til avstanden som migrerte gjennom gelen. Skalaen vil skille dem inn i bånd av kjente størrelser, og kan brukes til å lede forskeren under analyse.