Innhold
- Påvisning ved bruk av fargeendringer
- Bruke en ELISA-leser for måling
- Direkte konkurrerende ELISA (cytokrom c)
- Inkuber det primære antistoffet i rør
ELISA-testen er en enzymbundet immunosorbentanalyse som bruker antistoffer eller antigener koblet til et bestemt enzym for å bestemme konsentrasjonen av antistoff eller antigen. Hvis du tar en ELISA og ikke kan bruke spesifikke antistoffer for å oppnå resultatene, foreslås konkurrerende ELISA fordi det bruker et antigen som er konjugert til et enzym i stedet for antistoffet og en annen deteksjonsmetode.
Påvisning ved bruk av fargeendringer
En felles protokoll for konkurranse ELISA er å bruke et umerket og renset primært antistoff. Antistoffet belegger brønnene til en mikrotiterplate og inkuberes med ukjente standarder. Et immunogen blir så tilsatt til konjugat med det primære antistoffet, som vil binde til antistoffsider som ikke er opptatt. Et substrat brukes da til å opprette en fargeendring for å måle bindende konsentrasjon.
Bruke en ELISA-leser for måling
Bruk en mikrotiter-polystyrenplate og legg det primære antistoffet til hver brønn. For å oppnå maksimal binding, fyll brønnen med ett mikrogram av antistoffet. Inkuber platen i fire timer ved romtemperatur. Tilsett det primære oppsamlingsantistoffet og vask brønnene med PBS (fosfatbuffet saltvann). Inkuber plater med blokkeringsbuffer i to timer ved romtemperatur. Vask brønnene to ganger med PBS og legg til standardene. Plasser antigen-konjugatoppløsningen i brønnene og inkuber igjen i to timer. Vask platen igjen med PBS fire ganger. Legg substratet og måle tetthetene ved den spesifikke bølgelengden ved hjelp av en ELISA-leser.
Direkte konkurrerende ELISA (cytokrom c)
For en direkte konkurrerende ELISA må en serumfortynningsanalyse for antigenet du bruker i forsøket, utføres. Mikrotiterplaten belegges deretter med cytokrom c og inkuberes over natten. ELISA-delen av analysen utføres da ved tilsetning av blokkeringsreagens og sekundær antistoff. Absorbanseresultatene leses med en mikroplate leser.
Inkuber det primære antistoffet i rør
I denne prosedyren inkuberes det primære antistoff i reagensrør hvori antigenet av interesse binder seg til det. Prøvene tilsettes deretter til brønnene i mikrotiterplatene og inkuberes. Brønnene vaskes deretter for å fjerne eventuelle ubundne antigen-antistoffkomplekser, og deretter tilsettes blokkeringsløsningen for å forhindre at det andre antistoffet bindes til brønnene. Det sekundære antistoffet leses deretter på en plateleser for å oppnå resultatene.